您是否遇到這些難題？

1. 固定組織（PFA）無法提取高質(zhì)量RNA？

2. 樣本異質(zhì)性強(qiáng)，結(jié)果不準(zhǔn)確、不可靠？

3. 單細(xì)胞/空間轉(zhuǎn)錄組成本高、分辨率受限？

4. 珍貴病理樣本有限，不足夠開展多個(gè)實(shí)驗(yàn)？

例如在肝臟等復(fù)雜組織研究中提取RNA分析面臨以下挑戰(zhàn)：

組織異質(zhì)性嚴(yán)重：肝臟包含肝細(xì)胞、膽管上皮、免疫細(xì)胞等，傳統(tǒng)整體提取難以反映真實(shí)表達(dá)差異

空間信息丟失：單細(xì)胞測(cè)序需組織解離，破壞細(xì)胞原位信息

技術(shù)方案受限：空間轉(zhuǎn)錄組：圖像分辨率或通量受限；傳統(tǒng) LCM（Laser Capture Microdissection，激光捕獲顯微切割）大多使用新鮮樣本，無法利用大量病理固定組織

病理固定組織RNA難以提取，降解快，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化流程

臨床樣本珍貴：無法轉(zhuǎn)化為高質(zhì)量和足夠的RNA分析數(shù)據(jù)。

激光顯微切割，即LMD（Laser Microdissection）技術(shù)，精準(zhǔn)從組織切片中分離目標(biāo)單細(xì)胞 / 特定組織區(qū)域，適配后續(xù)核酸提取測(cè)序。南方醫(yī)科大學(xué)汪艷教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表于Journal of Visualized Experiments的工作中，第一作者曾偉蘭博士作為方法學(xué)核心執(zhí)行人，依托學(xué)?？蒲兄С种行模ㄖ行膶?shí)驗(yàn)室）平臺(tái)及該平臺(tái)配備的徠卡LMD激光顯微切割系統(tǒng)，成功構(gòu)建了一套從固定組織到RNA測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)化解決方案，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)到單細(xì)胞級(jí)別分選，兼容PFA固定+冰凍切片樣本，5天內(nèi)完成從取材到測(cè)序建庫，1000個(gè)細(xì)胞即可獲得高質(zhì)量RNA分析結(jié)果的實(shí)踐方案。該方案提供了一套完整可重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程：樣本制備 → LMD 精準(zhǔn)切割 → RNA提取 → qPCR / RNA-seq。

真正實(shí)現(xiàn)：固定組織 → 精準(zhǔn)分選 → 高通量分子分析

關(guān)鍵技術(shù)突破

01、固定組織RNA提取優(yōu)化

控制PFA固定時(shí)間24h，避免蛋白-核酸過度交聯(lián)不可逆損傷RNA

優(yōu)化解交聯(lián) + 蛋白酶K消化體系，提高RNA釋放效率

RNase全流程控制，保障RNA穩(wěn)定性

02、高效LMD取樣策略

快速蘇木素染色替代復(fù)雜免疫染色

單張切片30–60min內(nèi)完成切割，全部切割4h內(nèi)結(jié)束，高效完成目標(biāo)采集

精準(zhǔn)圈選目標(biāo)細(xì)胞群，避免污染

03、微量樣本高質(zhì)量輸出

1000 cells → \~110 ng RNA

A260/A280：1.9–2.1

文庫片段：300–500 bp（符合測(cè)序要求）

該方案從臨床到科研全面釋放樣本價(jià)值：

肝病機(jī)制研究（MASH、肝損傷、纖維化等）

特定細(xì)胞群表達(dá)譜分析

微環(huán)境與免疫細(xì)胞研究

固定病理樣本回顧性研究

為什么選擇徠卡LMD激光顯微切割系統(tǒng)

高精度激光切割，細(xì)胞級(jí)分辨率

參數(shù)可控，適配不同組織類型

可在空間背景下通過可視化控制，實(shí)現(xiàn)純凈、無接觸、無污染的樣本采集

具備高通量處理能力，適應(yīng)下游質(zhì)譜等分析需求

樣本采集使用標(biāo)準(zhǔn)耗材，通用方便

LMD激光顯微切割系統(tǒng)不僅是一臺(tái)激光顯微切割顯微鏡，更是一套完整DVP解決方案，將細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)與分子連接，打開病理樣本高價(jià)值再利用的可能。

汪艷教授團(tuán)隊(duì)優(yōu)化的LMD顯微切割步驟：

本流程參考了既往文獻(xiàn)的LMD通用操作規(guī)范，并針對(duì)固定組織中RNA易降解的特性，進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整。

1.用去除RNase試劑擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái)面與儀器表面。

2.開啟LMD控制器，等待顯微鏡完成初始化。

3.擰動(dòng)激光器鑰匙至開機(jī)檔位，啟動(dòng)LMD激光系統(tǒng)。激光預(yù)熱10分鐘。

4.打開電腦及LMD軟件，等待軟件初始化結(jié)束。

5.將0.2mL PCR管裝入收集裝置。

6.在PCR管蓋中加入10μL RNA提取緩沖液（RNeasy FFPE 試劑盒配套試劑）。

7.將收集裝置裝回顯微鏡。

8.在LMD收集設(shè)備設(shè)置界面，點(diǎn)擊 “移至參考點(diǎn)"，調(diào)節(jié)相機(jī)焦距使參考點(diǎn)成像清晰，必要時(shí)通過方向按鍵將參考點(diǎn)調(diào)至視野中央，進(jìn)行收集設(shè)備位置校準(zhǔn)。

9.組織切片面向下、標(biāo)簽朝右裝入標(biāo)本夾。

10.選用10倍物鏡定位樣本區(qū)域，進(jìn)入激光菜單點(diǎn)擊校準(zhǔn)，彈窗選擇確認(rèn)。

11.設(shè)置激光參數(shù)（供參考）：Power 50、Aperture 5、Speed 9。

12.工具欄圈選目標(biāo)區(qū)域，選擇單一圖形，點(diǎn)擊開始切割；組織粘連無法自動(dòng)掉落時(shí)，可選用手動(dòng)裁切模式。警示：操作中禁止直視激光束，防止輻射損傷。

13.可通過軟件菜單保存切割前后鏡下畫面。

14.收集足量細(xì)胞后卸下收集組件，再次向管蓋補(bǔ)加提取緩沖液至終體積10μL，密封PCR管。

15.充分渦旋混勻收集管。

16.短暫離心，樣品- 80℃保存待用。后續(xù)樣本重復(fù)5～16步，切割結(jié)束可暫停實(shí)驗(yàn)，待統(tǒng)一提取RNA。

注意：單張玻片樣品顯微切割用時(shí)控制在30分鐘～1小時(shí)，全部切割操作建議4小時(shí)內(nèi)完成。

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激光顯微切割 Leica LMD6 & LMD7